新冠疫情之下，“测核酸”已成为全民热词，PCR作为测核酸的官宣仪器也火爆热卖，这里指的是荧光定量PCR（qPCR）。

大家知道，有时的“漏检”是因为病毒的copy数太低；而若想减少甚至消除“漏检”，可用另一种更灵敏更精准的数字PCR（digital PCR，dPCR）技术。

dPCR和qPCR到底有何区别？

为什么说dPCR的效果更好？

它能解决哪些问题？

国内外有哪些dPCR的玩家？

本文将揭秘dPCR的前世今生，并对市场上dPCR的代表性产品逐一展示，希望能为您下次入囊前做点儿准备。

PCR定量发展简史

PCR即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），它以DNA双链复制原理为基础，对特定核酸样本进行体外扩增，能够将微量的核酸样本迅速拷贝至几百万倍。

自1985年美国科学家Kary Mullis发明PCR以来的三十多年，PCR经历了三代技术的发展。

第一代与第二代

第一代传统PCR技术，采用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行定性分析；第二代荧光定量PCR（qPCR）技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控PCR进程，最后用进入扩增指数期时的Cq值（罗氏）或Ct值（AB/赛默飞）对基因进行定量分析。

为何第一代PCR只能定性？

这是因为PCR反应事实上呈现S型，在反应终点区测定终点产物的数量误差很大，因此只能定性。第二代qPCR利用拐点产物数量定量，重现性好，当结合标准曲线后，可以实现绝对定量。这同分析化学上讲的定量方法并无区别，实现定量，需要找到标准样品，需要做标准曲线。

第三代

下面我们重点说说神奇的第三代数字PCR（dPCR）技术。

这种定量技术，既不需要标准品，也不需要做标准曲线，即可实现对起始样本的绝对定量，灵敏度和准确度还特别高。纵观当今分析技术，唯有dPCR可以实现不需标准曲线的绝对定量，足可笑傲定量江湖，用降维打击、一举封神、YYDS等各种赞誉来形容它都挺合适。

dPCR的基本原理是：通过将PCR反应液进行有限稀释，实现核酸分子的单分子扩增，最终采取终点法检测阳性微滴的荧光信号，有荧光信号的微滴判读为 1；没有荧光信号的微滴判读为 0，因此该技术被称为数字PCR。

简而言之，就是把复杂的定量工作简化成“1”和“0”，没有寻找标准品的困扰，没有做标准曲线的烦恼，把所有人为误差统统丢掉，这就是dPCR被誉为PCR技术之未来的底气。

dPCR的诞生

1992年，Sykes等在检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时，利用样品的有限稀释，让每个微孔只获得单个模板分子，通过计算PCR后的扩增信号，以期准确确定原始分子的数量。虽然没有明确提出“数字PCR”的概念，但是已经建立了数字PCR基本的实验流程，并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法，这是数字PCR的雏形。

1999年，霍普金斯大学的Bert Vogelstein和他的同事Kenneth Kinzler等在分析癌症突变的罕见基因型过程时，因受到体细胞基因的干扰，而遇到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈，采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式，从而明确提出了数字式PCR（dPCR）的概念，同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高，从而指出了dPCR系统的发展方向。

dPCR是PCR技术上里程碑式的飞跃，其概念被提出后，受限于当时的技术条件，如样本稀释及分配都是靠手工来完成的，干扰和限制因素较多；并且结果分析对于研究者来说也十分枯燥与繁琐，因此在很长一段时间dPCR发展停滞不前。

后来由于微流控技术与微纳集成制造工艺的发展解决了dPCR应用过程中的几个关键技术问题，推动了dPCR的研究与商业化的发展。